Synthèse convergente d'oligonucléotides morpholino phosphorodiamidate (PMO) par le H

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 12576 (2023) Citer cet article

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Les oligonucléotides phosphorodiamidate morpholino (PMO) sont un type prometteur d’oligonucléotides antisens, mais leur synthèse difficile les rend difficiles d’accès. Cette recherche présente une approche de synthèse efficace pour les PMO utilisant l’approche H-phosphonate. L'utilisation de réactifs de condensation de type phosphonium a considérablement réduit les temps de couplage par rapport à l'approche de synthèse actuelle. De plus, les réactifs de condensation de type phosphonium ont facilité la condensation des fragments du PMO, synthétisant jusqu'à 8-mères contenant les quatre bases nucléiques avec une efficacité de couplage remarquable. Il s’agit du premier rapport sur la synthèse convergente des PMO. Cette approche faciliterait la synthèse à grande échelle des PMO et accélérerait leur popularité et leur accessibilité en tant que thérapie de nouvelle génération.

L’approche antisens a attiré l’attention des chercheurs en tant que future thérapie potentielle pour contrôler l’expression de gènes liés à la maladie1,2,3. Les oligonucléotides morpholino phosphorodiamidate (PMO), dotés de liaisons internucléotidiques non ioniques et d'un squelette morpholino, sont considérés comme des médicaments antisens prometteurs4,5. La forte affinité de liaison pour cibler l'ARNm4, la spécificité de séquence6,7, la solubilité dans l'eau6 et la faible toxicité du PMO7,8,9,10 ont été confirmées dans des études antérieures. À ce jour, quatre médicaments antisens pour la dystrophie musculaire de Duchenne ont été approuvés (Exondys 51®11, Vyondys 53®12, Viltepso®13, Amondys 45®14) et d'autres médicaments PMO devraient être approuvés à l'avenir. De plus, un nouvel analogue du PMO appelé thiophosphoramidate morpholino oligonucléotides (TMO) a été synthétisé et a montré son potentiel en tant que nouveau médicament candidat dans la thérapie antisens15. Les progrès rapides des PMO ont accru la nécessité de développer des approches efficaces pour synthétiser les PMO et leurs analogues. En particulier, l’approche synthétique, qui permet de synthétiser simultanément des PMO à grande échelle, est nécessaire pour permettre aux patients de bénéficier d’une thérapie antisens. Jusqu’à présent, de nombreuses approches synthétiques ont été développées. La première approche synthétique pour les PMO a été rapportée par Summerton et Weller5 (Fig. 1-A). Dans cette approche, des nucléosides morpholino portant un fragment N,N-diméthylaminochlorophosphoramidate sur le groupe 5ʹ-hydroxy et un groupe trityle (Tr) sur le groupe amino ont été utilisés comme unités monomères (A). Les PMO ont été synthétisés en répétant la condensation du groupe 5ʹ-N,N-diméthylaminochlorophosphoramidate du monomère (A) avec le groupe amino à l'extrémité 3ʹ de l'oligomère après élimination du groupe Tr à l'extrémité 3'5. Cette approche est largement utilisée mais présente plusieurs problèmes reconnus, notamment la faible réactivité des monomères et les longs temps de réaction pour achever la réaction de condensation. En 2012, Harakawa et al. ont découvert que l’ajout de LiBr à un mélange réactionnel était efficace et entraînait une accélération considérable de la réaction (amélioration d’environ dix fois)16. De plus, Li et al.17 ont découvert qu'en augmentant la température de réaction à 90 °C, la réaction de condensation était achevée en 8 minutes, ce qui leur permettait de synthétiser un 18mer-PMO en seulement 3,5 heures à l'aide d'un réacteur à flux. Kundu et al.18 ont rapporté la synthèse de PMO à l'aide d'un synthétiseur oligo automatisé. Dans ce rapport, une synthèse en phase solution de PMO 3-mer a été réalisée en utilisant la chimie Fmoc. De plus, les PMO 30-mer ont été synthétisés par un synthétiseur d'ADN.

Approches actuelles pour la synthèse de dérivés PMO.

Récemment, Langner et al.15 ont rapporté une nouvelle approche de synthèse pour la synthèse de TMO utilisant des dérivés de phosphorodiamidite comme monomères (Fig. 1-B). Contrairement au PMO, les TMO ont une liaison phosphorothioamidate, qui a montré des propriétés prometteuses en tant qu'oligonucléotides antisens. Les TMO ont montré une affinité de liaison à l'ARN élevée et une stabilité élevée des nucléases. De plus, les TMO chimériques ont montré leur potentiel en tant qu’inhibiteurs de microARN. Comme le montre la figure 1-B, cette approche utilise des dérivés morpholino phosphorodiamidite portant un groupe 4,4ʹ-diméthoxytrithyle (DMTr) sur le groupe 5ʹ-hydroxy (B) comme unités monomères. Le processus de synthèse impliquait la condensation d'un monomère morpholino phosphorodiamidite (B) avec le groupe hydroxy à l'extrémité 5ʹ de l'oligomère en présence d'un activateur acide, tel que le 5-éthylthio-1H-tétrazole (ETT), suivie d'une sulfuration de un intermédiaire phosphoramidite (C). Une détritylation ultérieure suivie de cycles de synthèse répétitifs a produit des TMO. Le rendement de couplage rapporté était de 95 à 97 %, avec un temps de réaction de condensation de 5 min15. Bien que cette approche soit efficace pour synthétiser des TMO, elle n’est pas applicable à la synthèse de PMO. Cette méthode a donné le dérivé phsphoramidite (C) comme intermédiaire, mais à partir de cet intermédiaire, la liaison phosphorodiamidate souhaitée du PMO n'est pas obtenue.